Введение

В рамках реализации Государственной стратегии развития фармацевтической отрасли Российской Федерации на период до 2030 года приоритетным направлением является производство лекарственных средств, в том числе растительного происхождения. Интерес к фитопрепаратам остается актуальным и сегодня благодаря их мягкому действию, малой токсичности и возможности длительного применения для профилактики и лечения различных заболеваний. С развитием науки и медицины создаются все более современные лекарства, но лекарственные растения по-прежнему являются основным гарантом будущего в медицине и сфере здравоохранения.

L. javanica - многолетнее кустарниковое, травянистое растение высотой до 4,5 м с крепкими ароматными листьями, которые при измельчении источают аромат лимона [15-17]. В природе встречается в центральной, восточной и южной Африке. В южной Африке этот вид произрастает в Ботсване, Малави, Мозамбике, ЮАР, Свазиленде, Замбии, Занзибаре и Зимбабве [15–16].

В течение многих лет кустарник используется в медицинской практике Южной Африки из-за богатого химического состава, а значит, обладает широким спектром фармакологической активности. Основные фармакологические эффекты включают противовоспалительное, антиоксидантное, антисимпластическое, антимикробное, противотуберкулезное и противовирусное действие, что позволит нам производить более качественные и безопасные эфирные масла в отдаленном будущем [23–25].

Исходя из этого, кустарник используют для лечения широкого спектра заболеваний [28-29]. По данным из разных источников, его применяют при лечении следующих заболеваний и их симптомов (табл. 1).

 

Таблица 1. Список заболеваний и методы применения Lippia Javanica

в медицинской практике

Заболевания	Метод применения Verbena Javanese
Простуда	Изготовление настойки из листьев и побегов или приготовление мази на основе листьев
Кашель	Приготовление настойки из листьев /стеблей /побегов, применение отвара в виде ингаляций
Больное горло	Приготовление отвара из листьев и полоскание на основе настойки листьев
Тонзиллит	Приготовление настойки из листьев
Лихорадка	Приготовление отвара из листьев
Инфекционные заболевания легких	Приготовление отвара из корней и листьев
Заложенность носа	Приготовление отвара листьев с добавлением измельченных составов из других лекарственных препаратов
Бронхит	Приготовление настойки из листьев или корней либо приготовление мази на основе листьев с последующим наложением под марлевую повязку на область горла
Боль в груди	Получение сока из листьев и корней
Астма	Приготовление отвара или ингаляций из листьев
Малярия	Приготовление отвара из листьев и корней
Носовое кровотечение	Приготовление отвара из листьев
Мигрень	Ингаляции на основе отвара листьев и стеблей
Анемия	Приготовление отваров на основе корней

 

На основании данных таблицы можно сделать вывод, что Lippia javanica наиболее часто используется при лечении отоларингологических и пульмонологических заболеваний, что делает перспективным ее долговременное использование в медицинской сфере уже в ближайшем будущем, включая получение новых спреев и производство новых пастилок от кашля, для оказания помощи людям.

Отдельно стоит отметить важность препаратов на основе Lippia Javanica при комплексном лечении коронавирусной инфекции (COVID-19). Это растение уже много лет широко используется при лечении инфекционных заболеваний, поэтому неудивительно, что местное население Южно-Африканского региона использовало эфирные масла, настойки, ингаляции и отвары Lippia Javanica для профилактики, а затем и при комплексной терапии новых штаммов COVID-19 [25]. Отсюда следует простой вывод, что данное лекарственное растение открывает возможность для более широкого исследования, поэтому в ближайшем будущем будет запущено массовое производство препаратов против микробов и вирусов, поскольку растение содержит полифенолы и флавоноиды, которые обладают такими эффектами.

Составы эфирных масел значительно различаются в зависимости от места происхождения, сезона сбора урожая и погоды. Сложный молекулярный состав многих эфирных масел требует сепарации с высоким разрешением, чтобы охарактеризовать ряд соединений, входящих в состав масел. Кроме того, часто бывает необходимо изучить небольшие различия между маслами, которые соответствуют различиям в географическом или генетическом происхождении растительного материала.

Хроматография, особенно газовая хроматография (ГХ) и масс-спектроскопия (МС), были наиболее применяемыми аналитическими методами анализа эфирных масел. Однако, ограничения ГХ и ГХ-МС подтолкнули хроматографов к глубоким поискам более эффективных методов анализа летучих веществ эфирных масел, таких как улучшение подготовки проб перед инъекцией. Были протестированы такие методы, как перегонка с водяным паром, динамический парофазный метод, статический парофазный метод и ТФМЭ (твердофазная микроэкстракция). В результате теперь передовым методом ввода пробы является статический парофазный метод (ПФГХ).

Важно учитывать, что ГХ-анализ эфирных масел обычно проводится для оценки конкретного растения или травы на предмет процентного содержания масла и компонентов. Однако, аналитические значения, полученные таким образом, не относятся непосредственно к летучим веществам в составе самой травы, и могут некорректно отражать действительное качество травы в зависимости от используемой методики выделения. Однако применение такого метода, как статический парофазный метод в ГХ, позволяет получить только профайл эфирных масел.

Масс-спектрометрию (МС) можно определить как исследование систем путем образования газообразных ионов с фрагментацией или без нее, которые затем характеризуются отношением массы к заряду (м/з) и относительными количествами [41]. Аналит может быть ионизирован термическим методом, электрическим полем или воздействием электронов высокой энергии, ионов или фотонов.

Последнее десятилетие ознаменовалось огромным ростом популярности масс-спектрометров в качестве инструментов как для стандартных аналитических экспериментов, так и для фундаментальных исследований. Это связано с рядом особенностей, включая относительно низкую стоимость, простоту конструкции и чрезвычайно высокую скорость сбора данных. И, хотя в процессе образец разрушается масс-спектрометром, этот метод очень чувствителен, и при анализе используется лишь небольшое количество материала.

Однако, как хорошо известно, такие соединения, как изомеры, при анализе с помощью ГХ-МС могут быть неправильно идентифицированы; этот недостаток часто наблюдается при анализе эфирных масел. Широко известно, что состав эфирных масел в основном представлен терпенами, которые дают весьма схожие масс-спектры; следовательно, благоприятного коэффициента совпадения недостаточно для идентификации, и назначение пиков становится трудной и даже неневыполнимой задачей.

С другой стороны, при условии, что данные, содержащиеся в библиотеках масс-спектров, были записаны с использованием подлинных образцов, можно заметить, что масс-спектр отдельно взятого терпена обычно достаточен для обеспечения его идентификации в сочетании с индексом удерживания, полученным при метилсиликоновых стационарных фазах.

 

Материалы и методы

Объектом исследования была трава Lippia Javanica. Для определения оптимальных результатов были проведены фармакогностический анализ, макроскопический анализ, микроскопический анализ, количественный анализ эфирного масла и его качественный анализ. Определение содержания эфирного масла проводили методом паровой дистилляции травы Verbena Officinalis и травы Lippia Javanica с последующим измерением объема. Массовую долю выражали в процентах отношения массы к объему в расчете на абсолютно сухое сырье или препарат. Для проведения опыта использовали Метод 2 Фармакопеи РФ .1.5.3.0010.15 «Определение содержания эфирного масла в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах». Используемый материал: дистиллированная вода, 10% раствор гидроксида натрия, глицерин, оборудование для измерения содержания эфирных масел, аналитические весы, микроскопия, чашки Петри. На аналитических весах взвешивалось 50 граммов измельченной травы Verbena Officinalis и Lippia Javanica, соответственно. Образец помещался в круглодонную колбу, куда добавлялось 500 мл дистиллированной воды. Процесс паровой дистилляции эфирного масла занял два часа.

Все данные были получены с использованием следующего оборудования:

– ПФ-автосамплер TriPlus 500 (Thermo Scientific)

– Газовый хроматограф TRACE 1300 (Thermo Scientific)

– MS-обнаружение с помощью ISQ 7000 (Thermo Scientific)

– Рабочая станция ПК с Chromeleon CDS ver. 7.2.10

- Библиотека MS NIST 16

Сепарацию проводили на капиллярной колонке TraceGold 5 30 м x 0,32 мм x 0,25 мм (Thermo Scientific) в программируемом температурном режиме.

 

Параметры парофазного метода:

Температура инкубатора (C0)	110
Время инкубации (мин)	45
Режим смешивания в пробирках	Быстрый
Режим герметизации пробирок	Под давлением
Давление в пробирке (КПа) (доп. газ – азот)	130
Время балансировки давления (мин)	1
Объем контура (мл)	1
Температура контура/интерфейса (C0)	120
Нагрузочное давление в контуре (kPa)	74,2
Время балансировки контура (мин)	1
Режим впрыска	Стандартный
Время впрыска (мин)	1

 

Параметры ГХ:

Узел впрыска образца	Пневматический контур разъемный/неразъемный
Температура узла впрыска образца (C0)	200
Коэффициент разделения	25:1
Газ-носитель	Гелий
Поток газа-носителя (мл/мин)	1,5 (режим постоянного потока)
Капиллярная колонка	Капиллярная колонка TraceGold 5 30 м x 0,32 мм x 0,25 мм (Thermo Scientific)
Температура колонки	Программируемый температурный режим: начиная с 900C (5 минут) до 2600C (100 в мин), и удержание на 10 минут
Детектор	МС

 

Параметры МС:

Система МС	Детектор МС на базе одиночного квадрупольного масс-анализатора
Интерфейс/источник ионов	Интерфейс воздействия электронов (ВЭ) 70 eV
Температура интерфейса/источника ионов (C0)	150
Температура в коллекторе (C0)	50
Квадрупольная температура (C0)	180
Соотношение сканированных масс (Da)	35 - 450

 

Идентификация пиков предоставлена библиотекой NIST 16 MS.

 

Результаты и обсуждения

Результат фармакогностического анализа представлен микроскопическими признаками, включая устьица, эфироваскулярные железы и короткие простые одноклеточные волоски, показанные на рис. 1-3.

В результате качественного анализа установлено наличие эфирного масла в траве L. javanica. Собранный объем достиг около 20 мл. Он не имел вязкой и маслянистой консистенции, скорее всего, эфирные масла Lippia Javanica термолабильны. Получилась водянистая жидкость с характерным сильным запахом и вкусом, рисунок 4.

Качественный анализ на другие активные вещества был проведен в течение 30 минут. Были использованы следующие реагенты: аммиак 10%, гидроксид натрия 10%, сульфат железа аммония, молибдат натрия, хлорид железа.

 

Рисунок 2. Сырьё Lippia Javanica под микроскопом (1 - Полости эфирного масла)

 

Рисунок 3. Исходный материал Lippia Javanica под микроскопом (1- Длинные железистые простые одноклеточные волоски).

Рисунок 4. Органолептические испытания эфирных масел Lippia Javanica

 

Также был проведен качественный анализ возможных активных соединений. L. javanica показала наличие флавоноидов при реакции с 10%-ным аммиаком, желтую окраску и бледно-желтую окраску с 10%-ным раствором гидроксида натрия. Желтая окраска с сульфатом железа и аммония свидетельствует о наличии танинов. Темно-зеленое окрашивание хлоридом железа показало присутствие фенола и флавоноидов в обоих растениях. Lippia Javanica давала бледно-красную окраску с молибдатом натрия, указывающую на присутствие фенолов.

 

Сырое эфирное масло из Lippia Javanica экстрагировали с помощью паровой дистилляции. Сырое масло было помещено в 20-миллилитровую пробирку и закупорено. Суммарная ионная хроматограмма (СИХ), полученная в указанных выше условиях, представлена на рис. 1.

 

 

 

На хроматограмме зарегистрированы сигналы 54 компонентов. Часть пиков, особенно в конце хроматограммы, идентифицированы как компоненты стационарной жидкой фазы. Большинство незначительных компонентов идентифицировано как эфиры спиртов С4-С10 и кислот С2-С5, а также бензойная кислота. Несколько незначительных пиков идентифицированы как простые терпены, такие как гераниол, пинен и цинеол. Основные компоненты были идентифицированы как бензойная кислота (пик при 7,298), фенилметилбензоат (пик при 15,671), этиллинолаол (пик при 16,581) и его цис-изомер (пик при 16,690), мехинол (пик при 18,093), пиперонал (пик при 18,442), изоцитронеол и коримболон (пики 22,827 и 23,300 соответственно). Результаты поиска в библиотеке МС показаны на рис. 2.

 

 

Выводы.

Проведена химическая классификация эфирных масел. Описаны особенности химического строения, и физико-химические свойства эфирных масел.

В литературе отмечалось, что Lippia Javanica использовалась в качестве добавки к другим лекарствам для борьбы с коронавирусом (COVID-19) в южноафриканском регионе.

В данном научном исследовании представлен метод определения содержания эфирного масла, описана его количественная оценка и оценка качества сырья. Исследование идеально подходит для применения на практике и поможет в ближайшем будущем расширить сферу медицины и фармацевтики за счет внедрения таких эфирных масел, добываемых наиболее дешевыми и эффективными способами.

В исследовании учитываются внешние особенности, географическое распространение и места обитания Lippia Javanica, содержащие эфирные масла. Идея состоит в том, чтобы импортировать лекарственное растение из стран Южной Африки по более низкой цене и производить больше лекарств здесь, в Российской Федерации, или построить фармацевтическую производственную компанию в Зимбабве для производства высококачественных и безопасных эфирных масел для местного населения. Обнаружено, что L. javanica содержит эфирные масла более высокого качества, что дает положительный результат разработки концепции производства лекарственных и косметических эфирных масел более высокого качества и безопасности для населения.

Обзор литературы и практическая часть показали, что в L. javanica есть термолабильные эфирные масла, однако им недостает вязкости и маслянистой консистенции, и исследовательские работы будут проводиться с другим способом выделения термолабильных эфирных масел. Можно использовать альтернативный метод, чтобы разработка производства эфирных масел из Lippia javanica велась индивидуально или с помощью грантов.

Дополнительно были учтены макро- и микроскопические признаки, а также подтверждены все возможные диагностические признаки на Lippia Javanica. Качественный анализ показал, что L. javanica содержит флавоноиды, танины, а также фенолы, что проявляется бледно-красной окраской при взаимодействии с молибдатом натрия.

В связи с этим, состав эфирного масла L. javanica был изучен методом ПФ-ГХ-МС, который показал, что эфирное масло состоит из более чем 50 соединений терпенов, простых эфиров, альдегидов и ароматических кислот.

Таким образом, Lippia Javanica может быть введена в медицинскую практику в качестве источника эфирных масел и других фитохимических веществ по причине ее лечебной ценности. Необходимо провести исследование с последующим получением патента или продажей крупным фармацевтическим компаниям, чтобы они могли производить больше эфирных масел и других лекарств, таких как НПВП[1], на основе Lippia javanica.

Файлы:

• ПЕРЕВОД_IDENTIFICATION_OF_ESSENTIAL_OILS_IN_LIPPIA_JAVANICA.pdf
• IDENTIFICATION_OF_ESSENTIAL_OILS_IN_LIPPIA_JAVANICA.pdf